KRER: Cross-Kingdom RNAi for enhancing plant resistance

Finanziato dall'Unione Europea - NextGenerationEU a valere sul Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) – Missione 4 Istruzione e ricerca – Componente 2 Dalla ricerca all’impresa - Investimento 1.1, Avviso Prin 2022 indetto con DD N. 104 del 2/2/2022, dal titolo "Cross-Kingdom RNAi for enhancing plant resistance-KRER", codice proposta 2022LBK9R4- CUP J53D23010160006.

Parassiti e patogeni sono responsabili di circa il 40% delle perdite della produzione agricola globale, evidenziando l'urgente necessità di sviluppare strategie sostenibili di protezione delle colture che consentano di aumentare la produttività agricola riducendo al contempo la dipendenza dai pesticidi. In linea con gli obiettivi del Green Deal europeo, il presente progetto mira a ridurre l'impatto delle malattie, limitare l'impiego di fungicidi e ampliare le conoscenze fondamentali sulle interazioni pianta–patogeno attraverso lo sviluppo di varietà colturali resistenti mediante innovative tecnologie basate sull'RNA. Il progetto si concentra su due colture di elevata importanza economica, vite e pero, minacciate da patogeni di primaria rilevanza, tra cui Botrytis cinerea (muffa grigia), Plasmopara viticola (peronospora della vite) e Stemphylium vesicarium (maculatura bruna del pero).

La strategia proposta si basa sull'Host-Induced Gene Silencing (HIGS), un approccio fondato sull'interferenza a RNA (RNA interference, RNAi) che sfrutta il naturale meccanismo di silenziamento genico della pianta per colpire e sopprimere geni essenziali del patogeno. L'RNAi è indotta da RNA a doppio filamento (double-stranded RNA, dsRNA), successivamente processato in piccoli RNA di 21–24 nucleotidi, capaci di silenziare in modo sequenza-specifico i geni bersaglio. Un numero crescente di evidenze dimostra che questi piccoli RNA possono essere trasferiti in modo bidirezionale tra pianta e patogeno, inducendo un silenziamento genico reciproco attraverso il meccanismo di RNAi cross-kingdom. Si ritiene che tale trasferimento avvenga, almeno in parte, mediante vescicole extracellulari che veicolano i segnali di RNAi tra gli organismi interagenti.

Il progetto integra attività di ricerca applicata e di ricerca di base, comprendendo: la valutazione di linee di vite HIGS che esprimono costrutti genici diretti contro la muffa grigia e la peronospora; lo studio dei meccanismi di RNAi cross-kingdom e del trasferimento di RNA mediato da vescicole extracellulari durante l'interazione pianta–patogeno; lo sviluppo di piante di pero tolleranti alle malattie mediante il trasferimento delle conoscenze e delle metodologie sviluppate nella vite. Inoltre, il progetto esplora il transgrafting, un'innovativa applicazione dell'innesto convenzionale nella quale portinnesti geneticamente modificati producono costitutivamente molecole di dsRNA in grado di conferire protezione ai nesti non transgenici. Questo approccio presenta importanti vantaggi dal punto di vista normativo e dell'accettazione pubblica, poiché i tessuti raccolti e i frutti rimangono geneticamente non modificati.

I risultati attesi comprendono lo sviluppo di piante di vite e di pero con una maggiore resistenza alle principali malattie fungine, la riduzione della necessità di trattamenti fungicidi chimici e un approfondimento delle conoscenze sui meccanismi di comunicazione mediati dall'RNAi tra piante e patogeni.

Risultati attesi

Il progetto consentirà di ottenere piante di vite e pero con maggiore resistenza alle principali malattie fungine, riducendo la necessità di trattamenti chimici. I risultati attesi includono anche un avanzamento delle conoscenze sui meccanismi di RNAi tra organismi diversi e lo sviluppo di strumenti innovativi per il miglioramento genetico, contribuendo a una produzione agricola più sostenibile ed efficiente.

Risultati raggiunti

Il progetto ha raggiunto con successo gli obiettivi principali originariamente previsti, senza modifiche sostanziali alle attività programmate. In particolare, sono state ottenute piante di vite HIGS con maggiore tolleranza al fungo B. cinerea, con una validazione completa nella cultivar Thompson Seedless e una validazione del portinnesto 110 Richter attualmente in fase conclusiva. Lo studio ha inoltre dimostrato il trasferimento dei segnali di RNAi cross-kingdom tra pianta ospite e il patogeno, confermando al contempo l'elevata specificità del silenziamento dei geni target.

Parallelamente, è stato sviluppato un protocollo efficiente per l'isolamento delle vescicole extracellulari (extracellular vesicles, EVs) da specie erbacee, successivamente adattato con successo ai tessuti della vite, inclusi calli coltivati in vitro e foglie. Le conoscenze acquisite sono state trasferite e adattate con successo anche a espianti di specie legnose.

Uno dei risultati più significativi è stata la dimostrazione della mobilità del segnale di RNAi nella vite mediante transgrafting. Piccoli RNA interferenti (small interfering RNAs, siRNA) prodotti nei portinnesti HIGS sono stati rilevati nei nesti wild-type (WT) innestati, fornendo una chiara evidenza del trasferimento a lunga distanza del segnale. Tali siRNA mobili hanno conferito ai nesti WT non trasformati una maggiore tolleranza a B. cinerea, riducendo significativamente l'infezione del patogeno a livello fogliare.

Sono state inoltre ottenute linee transgeniche di vite HIGS contenenti costrutti di espressione per i geni DCL1 e DCL1/2 dell'oomicete P. viticola, che sono state caratterizzate e valutate durante una stagione vegetativa. Contestualmente, è stato sviluppato un nuovo costrutto per l'espressione tessuto-specifica del dsRNA, finalizzato a ottenere un'espressione mirata nella regione cambiale.

Un'analisi genomica comparativa condotta su 47 genomi di S. vesicarium provenienti da differenti piante ospiti ha consentito di identificare sei geni presenti esclusivamente nei ceppi isolati da pero. Questi potenziali geni bersaglio sono stati valutati come dsRNA mediante la tecnica Spray-Induced Gene Silencing (SIGS) su foglie distaccate di pero, al fine di verificarne il possibile impiego. Il progetto ha inoltre prodotto e sottoposto a una validazione preliminare piante di pero HIGS che esprimono costrutti nuovi o precedentemente sviluppati, con l'obiettivo di incrementare la tolleranza o la resistenza a S. vesicarium, estendendo così l'applicabilità della strategia HIGS a un'ulteriore coltura frutticola di rilevanza economica.

I patogeni in oggetto presentano caratteristiche biologiche differenti e, in particolare, l'oomicete P. viticola, in quanto biotrofo obbligato, ha richiesto un'attenta ottimizzazione delle metodologie di inoculazione per ottenere inoculi artificiali. La recalcitranza alla trasformazione genetica e i lunghi tempi necessari per la rigenerazione e la selezione delle piante rappresentano tuttora le principali criticità nello sviluppo di nuove

linee HIGS. Sebbene per la cultivar Thompson Seedless sia ormai disponibile un protocollo consolidato, per altri genotipi, in particolare per portinnesti quali 110 Richter, il protocollo è ancora in fase di ottimizzazione, con significativi progressi conseguiti grazie al progetto.

Nonostante la nota recalcitranza delle cultivar e dei portinnesti di pero alla trasformazione e rigenerazione in vitro, è stato possibile ottenere tre linee HIGS della cultivar Conference, mentre promettenti germogli transgenici sono stati rigenerati nella cultivar Abate. L'ottimizzazione del protocollo per l'isolamento delle EVs da tessuti legnosi consentirà di dimostrare il trasferimento del segnale di RNAi cross-kingdom. Il protocollo recentemente standardizzato per l'inoculazione artificiale di P. viticola sarà applicato alle piante HIGS per validare i risultati preliminari ottenuti fino ad oggi.

Nel complesso, i risultati conseguiti forniscono una solida base tecnica per future applicazioni a livello di campo. Essi dimostrano la fattibilità dell'impiego del transgrafting quale strategia sostenibile non-GM per conferire tolleranza alle malattie nelle cultivar commerciali.

Lo sviluppo di un protocollo efficiente per l'isolamento delle vescicole extracellulari da piante modello e il suo adattamento, attualmente in corso, ai tessuti della vite aprono nuove prospettive per l'impiego delle EVs nella protezione delle colture. Per gli sviluppi futuri sarà prioritario procedere alla validazione su larga scala in condizioni di pieno campo, al fine di valutare la stabilità a lungo termine, la durabilità della tolleranza e le prestazioni ambientali della tecnologia. L'ampliamento delle strategie multi-target e la sperimentazione di ulteriori combinazioni portinnesto–nesto contribuiranno ad aumentarne la robustezza e la rilevanza commerciale. Parallelamente, saranno indispensabili approfondite analisi degli effetti off-target e della biosicurezza ambientale, al fine di supportare le procedure di valutazione del rischio e rafforzare la fiducia degli stakeholder.

Dettagli del progetto

• Programma di finanziamento: PRIN 2022
• D.D. del MUR : 104 del 02/02/2022
• Codice progetto MUR: 2022LBK9R4
• CUP: J53D23010160006
• Contributo al DISTAL: € 62.585,00
• Durata: 12/10/2023 - 28/02/2026
• Coordinatore: Università Politecnica delle Marche
• Ruolo DISTAL: RL
• Responsabile Scientifico: Elena Baraldi